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Le film met en scène le roi Léonidas I de Sparte (interprété par Gerard Butler) qui prend la décision audacieuse de rassembler 300 guerriers spartiates pour résister à l'immense armée perse dirigée par Xerxès (interprété par Rodrigo Santoro) lors de la bataille des Thermopyles. Léonidas et ses hommes s'engagent dans une résistance héroïque malgré les probabilités de succès très minces. Ils choisissent de combattre dans le passage étroit des Thermopyles, où l'armée perse ne peut pas déployer sa force totale.